2024年4月4日，黃志偉課題組在《細胞研究》（Cell Research）上發(fā)表題為《RAGATH-18衍生RNA引導的DNA核酸內切酶的發(fā)現和結構機制》（Discovery and structural mechanism of DNA endonucleases guided by RAGATH-18-derivedRNAs）的研究文章。該研究為基因編輯提供了新的酶工程模板，有助于克服現有基因編輯技術(shù)在遞送難、非目標效應和編輯效率低下等方面的困難。

細菌可進(jìn)化出多種防御系統來(lái)抵御噬菌體感染。限制性修飾（RM）系統可識別并在特定位點(diǎn)切割入侵的DNA序列。CRISPR-Cas系統則通過(guò)將入侵者衍生出的DNA短片段整合到CRISPR陣列中來(lái)提供適應性免疫。插入序列（Insertion sequences，ISs）是最普遍的移動(dòng)元件之一，也被細菌用來(lái)抵御外源感染。這些IS元件被分為不同的家族，在這些家族中，IS200/IS605和IS607轉座系統是兩個(gè)重要的成員。IS200/IS605轉座系統編碼的TnpB由一類(lèi)reRNA引導去切割基因組DNA，是一種可重新編程的RNA引導的核酸酶。IS200/IS605和IS607名稱(chēng)雖然相近，但二者發(fā)生轉座的機制并不相同，并且IS607 TnpB具體功能尚不清晰。

在該研究中，課題組首先運用生物信息學(xué)方法分析了所有可獲得的細菌和古細菌基因組以及來(lái)源于各種環(huán)境的宏基因組數據，在防御島上發(fā)現了一類(lèi)保守的RAGATH-18衍生RNA（reRNA）與IS607 TnpB共同出現。課題組通過(guò)一系列生化實(shí)驗證明了IS607 TnpB可與RAGATH-18衍生RNA（reRNA）相互作用，形成由RNA引導的核酸內切酶。課題組從9172株細菌中發(fā)現的10258個(gè)IS607TnpB系統中，鑒定出23種具有質(zhì)粒切割活性的IS607TnpB，同時(shí)發(fā)現9株IS607 TnpB在人體細胞中顯示出DNA干擾活性。這些IS607 TnpB有著(zhù)與IS605 TnpB完全不同的TAM識別序列（AGGAG或GAGGG）。IS605TnpB的reRNA序列存在于TnpB的編碼序列中，而IS607 TnpB的reRNA則完全獨立。其中，來(lái)自于厚壁菌門(mén)細菌（ Firmicutes bacterium）IS607 TnpB （ISFba1TnpB）在細胞內表現出較強的DNA剪切活性，并展示出高保真性的特征。

課題組進(jìn)一步通過(guò)冷凍電鏡（cryo-EM）解析ISFba1 TnpB-reRNA-DNA的復合物結構。該結構揭示了ISFba1TnpB蛋白（387 aa）可被reRNA識別的機制，以及ISFba1 TnpB對向導RNA和DNA底物之間的錯配更敏感的原因，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)ISFba1 TnpB用于基因編輯用途提供了結構基礎。

目前，CRISPR-Cas系統等基因編輯工具的優(yōu)化策略包括蛋白質(zhì)和向導RNA工程。課題組發(fā)現的IS607 TnpB系統具有體積小、對引導和靶向DNA堿基錯配的敏感性高的特點(diǎn)，為提高其精度、特異性和通用性提供了可能。通過(guò)蛋白工程優(yōu)化IS607TnpB的TAM序列，擴大其使用范圍，同樣也是未來(lái)值得探索的方向。IS607 TnpB具有RNA引導核酸酶活性的發(fā)現，擴充了IS系統潛在的核酸內切酶功能，為基因編輯工具開(kāi)發(fā)提供了新的酶工程模板。

黃志偉教授、張帆研究員為論文通訊作者。黃志偉課題組博士生任寬、周鳳俠博士、張帆研究員、博士生尹明雨、朱玉威副研究員、碩士生王首羽為論文并列第一作者。該課題組陳彥博士、博士生黃滕錦，西湖大學(xué)博士生吳紫璇、博士生何家樂(lè )以及生命科學(xué)中心公共平臺高級工程師郭長(cháng)友、工程師張安琪等參與研究部分工作。

該研究獲國家重點(diǎn)研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、騰訊新基石科學(xué)基金、黑龍江省頭雁團隊原創(chuàng )探索基金資助。

論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41422-024-00952-1

在基因組和宏基因組數據中鑒定RAGATH-18 RNA相關(guān)蛋白示意圖

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